Самурай Джек — основной и главный герой мультфильма, принц и наследник престола. Обучался у учителей со всего мира. Он владеет волшебным мечом, доставшимся ему от отца. Сначала в будущем он признан шпаной, но потом становится авторитетом и возглавит войска против злого Аку.

Аку (с яп. 悪 «Зло», также его имя может происходить от японского «Akuma» — демон) (†) — главный злодей в мультфильме, однако не лишён обаяния. Пользуясь тем, что Джек исчез, он поработил мир, став божеством для некоторых живущих во Вселенной. Злой демон, которого ранее победил отец самурая Джека. Аку силён в колдовстве: он умеет перевоплощаться в разных животных, антропоморфных существ и даже людей (тем не менее, это лишь одна из многочисленных сверхспособностей персонажа). Также Аку интересен зрителю ещё и тем, что он, в отличие от некоторых злодеев, умнеет с годами. Если в прошлый раз его победили волшебным мечом, во второй раз он не допустит этого. Спустя 50 лет, Аку уничтожает все существующие порталы, чтобы самурай не вернулся никогда в прошлое, ожидая момента, когда Джек умрёт от старости.

Шотландец (†) — лучший друг Джека. Большой рыжий мужчина, впервые встретивший Джека на очень длинном подвесном мосту. Сначала они были врагами, однако после многодневной схватки поняли, что у них одна цель, и за ними гонятся наёмники. После 50 лет он, как видно, значительно (в отличие от Джека) изменился во внешности. У него седые волосы с седой бородой, где в нижнем районе сплетены две маленькие косички и, по середине, длинная коса, он поменял свою белую рубашку на серую и заимел клетчатую глазную повязку на правом глазу. Что касается его арсенала, он сохранил свой волшебный меч, заимел миниган на левой ноге и инвалидной коляской, чтобы поддерживать свою новую левую ногу.

Дочери Аку — группа из семи женщин-гибридов, которые были рождены и воспитаны Верховной жрицей с единственной целью — убить самурая Джека. Они были частью секты Аку и появились полностью в первых трёх эпизодах 5 сезона.